吉林大學:利用CRISPR/Cas9構建轉基因豬

    來自吉林大學的研究人員報告稱，他們利用CRISPR/Cas9系統高效構建出了myostatin（MSTN）基因突變豬。這一研究成果發布在11月13日的《ScientificReports》雜志上。吉林大學的逄大欣（DaxinPang）教授及焦虎平（HupingJiao）是這篇論文的共同通訊作者。
    開發定制核酸內切酶技術可推動構建出轉基因動物，利用它們來探究基因功能及生成人類遺傳疾病模型。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9可在特異位點導入DNA雙鏈斷裂，然后通過非同源末端連接（NHEJ）或同源重組來進行修復。通常，NHEJ修復過程可在雙鏈斷裂區域造成小刪除或插入基因突變。由于高效且具備快速裝配能力，在這三種核酸內切酶技術中CRISPR/Cas9成為一種更強大的工具。當前，研究人員利用CRISPR/Cas9系統已成功構建出了斑馬魚、果蠅、小鼠和猴等許多的轉基因動物（延伸閱讀：Nature：突破性CRISPR技術生成“安全”轉基因作物）。
    Myostatin（MSTN）作為TGF-β超家族的一員，在肌肉生長中發揮負調控因子作用，其為改善家畜生長性能帶來了巨大的希望。相比野生型小鼠，MSTN基因敲除（KO）小鼠顯示出更結實的肌肉群，一些MSTN自然突變的牛品種也顯示更結實的肌肉群。以往的一些研究顯示，在進化過程中豬MSTN基因與牛和羊MSTN經歷不同的選擇壓力。有可能MSTN在豬中呈現不同的表達模式或起不同的作用。豬是世界上最重要的家畜之一，豬肉在中國的消費量尤其大。因此，構建出MSTN基因敲除豬對于調查其對肌肉發育和產肉性能的影響意義重大。
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    以往的研究報道稱，通過將Cas9mRNA和sgRNA胞質注射到受精卵內，或利用抗生素選擇的成纖維細胞進行體細胞核移植（SCNT）來生成基因靶向豬。但這兩種方法都有缺點。共同注射Cas9mRNA和sgRNA到受精卵中會生成具有多種表型的嵌合動物，且需要耗費時間和成本完成進一步的豬繁殖工作。來自藥物選擇成纖維細胞的遺傳工程豬往往攜帶著抗生素耐藥基因，它們正日益受到生物安全性關注。
    在這篇新文章中，吉林大學的研究人員報告稱他們將豬胚胎成纖維細胞（PFFs）的轉染效率提高了接近90%，由此提高了靶向載體的突變效率。他們還證實了CRISPR/Cas9系統可在豬胚胎成纖維細胞MSTN位點誘導NHEJ、長片段刪除/倒置及同源指導修復（HDR）。
    最后，研究人員通過體細胞核移植利用無選擇標記基因的Cas9/gRNA改造的成纖維細胞生成了基因靶向豬，獲得了了MSTN雙等位基因突變8只克隆小豬。一些小豬顯示明顯的肌間溝及大舌頭，這是雙?。―M）表型的特征。相比于對照，突變克隆豬的MSTN蛋白水平下降，他們還對MSTN的mRNA水平和相關信號通路因子進行了分析。最后，研究人員仔細評估了克隆豬中的脫靶突變。