豬圓環(huán)病毒(PCV) 是圓環(huán)病毒科、動(dòng)物圓環(huán)病毒屬的成員。該病毒科是國際病毒分類委員會(huì)(ICTV) 第6 次學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)新命名的一個(gè)科，是目前已知能自行復(fù)制的最小的哺乳動(dòng)物病毒。PCV可以分為PCV1 和PCV2 兩種血清型。PCV1 無致病性，但廣泛存在豬體內(nèi)及豬源代細(xì)胞系，1974 年，Tischer 首次從PK-15 豬腎傳代細(xì)胞系中分離。PCV2 具有致病性，該病主要以進(jìn)行性消瘦和多系統(tǒng)病理損傷為特征，可引起斷奶豬和育肥豬生長緩慢、呼吸急迫、消瘦、貧血、出現(xiàn)黃疸現(xiàn)象，剖檢后發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)腫大、肝硬變、多灶性黏液性氣管炎、間質(zhì)性肺炎和腎炎，給養(yǎng)豬業(yè)造成相當(dāng)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。1991 年，在加拿大首次暴發(fā)該病，隨后，世界各國和地區(qū)都有該病的報(bào)道，并在患斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎和腎病綜合征(PDNS) 等病豬體內(nèi)分離到PCV2，并證明PCV2 與這些嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的疾病密切相關(guān)。目前該病毒引起了國內(nèi)外獸醫(yī)界的廣泛關(guān)注。
1、病原學(xué)
豬圓環(huán)病毒（PCV）是一種小的均勻?qū)ΨQ的二十面體球形病毒、無囊膜、大?。?7±1.3）nm。PCV1 的病毒結(jié)構(gòu)蛋白為36 ku，而PCV2 的病毒結(jié)構(gòu)核酸組成。PCV 在CsCl 中的浮密度為1.37g/cm3，沉降系數(shù)為52 S，分子質(zhì)量為580 ku。PCV 對外界的抵抗力較強(qiáng)，在pH 為3的酸性環(huán)境中很長時(shí)間不被滅活。該病毒沒有囊膜，對氯仿等有機(jī)溶劑不敏感，在56 ℃或70 ℃氯仿處理一段時(shí)間，不被滅活。在高溫環(huán)境（72 ℃）也能存活一段時(shí)間。PCV 不具有血凝活性，不能凝集牛、羊、豬、雞等多種動(dòng)物和人的紅細(xì)胞。
2、PCV 的培養(yǎng)
PCV 在原代胎豬腎細(xì)胞、恒河猴腎細(xì)胞BHK-21 細(xì)胞上不能生長，PCV2 可在Vero 細(xì)胞中繁殖復(fù)制，最初生長不佳，但隨著代次的增加，生長狀態(tài)逐漸變好。PCV 通常在PK-15 細(xì)胞內(nèi)增殖，由于PK-15 細(xì)胞系中常污染有PCV1，且無論是PCV1 和PCV2都不形成CPE，所以在選擇用于PCV2培養(yǎng)的細(xì)胞時(shí)，必須事先進(jìn)行檢測。
3、基因組結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)
PCV 基因組為單鏈環(huán)狀DNA 分子。PCV1 基因組長度為1758 或1 759 bp，而PCV2 為1 767 或1 768 bp。兩者之間僅有68% 的序列同源性，而PCV2毒株之間序列同源性均95% 以上。PCV基因組最驚人的特點(diǎn)就是出現(xiàn)互相嵌套的開放閱讀框(ORF)。計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測PCV2 基因組中可能含有11 個(gè)開放閱讀框。PCV11 個(gè)ORF中只有ORF1和ORF2 的長度超過600 bp。PCV1 和PCV2 的ORF1 和ORF2 大小幾乎相同，其他9個(gè)ORF 除了ORF9 和ORF10以外，PCV2 都比PCV1 小，PCV1 在ORF1、ORF2、ORF4、ORF5、ORF6和ORF10 編碼的蛋白中含有糖基化位點(diǎn)，而PCV2 僅在ORF1、ORF4 中含有糖基化位點(diǎn)。ORFl和ORF2 為主要閱讀框，ORFl 編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep 蛋白，而ORF2 編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，即病毒核衣殼蛋白（Cap），研究表明Cap 蛋白與PCV2的免疫保護(hù)性有關(guān)。ORF1 變異較小，而ORF2變異較大。最近第3 個(gè)病毒基因ORF3被確定，ORF3 蛋白是一個(gè)高度保守的蛋白，在PCV2 各分離株之間氨基酸同源性達(dá)到95% 以上。其余的比較小的ORFs 的功能尚不明確。
4、流行特點(diǎn)
豬是PCV2 的天然宿主，各種年齡、不同性別的豬都可感染病毒，但以哺乳期和育成期的豬最易感，尤其是5 ～ 12周齡的仔豬，一般于斷奶后2 ～ 3 d 開始發(fā)病，急性發(fā)病豬群中，病死率可達(dá)10%，在疾病流行感染過的豬群中，發(fā)病率和死亡率都較低，如果并發(fā)或繼發(fā)細(xì)菌或病毒感染可使死亡率大大增加。加拿大是首次報(bào)道PMWS 的國家，但時(shí)至今日，多數(shù)農(nóng)場的豬群中仍然只是散發(fā)，很少呈流行性發(fā)生PMWS，但是與PCV2 有關(guān)的PNDS、心肌炎和繁殖障礙綜合征等疾病正引起了人們更多的關(guān)注。在美國，PCV2 感染和豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流感病毒引起的疾病相比較輕，發(fā)病慢而緩和，人們對PCV2 是否引起呼吸道疾病綜合征(PRDC) 這一問題仍存在異議。PCV2 感染10 ～ 12 周齡肥育豬，死亡率10% ～ 15%，淘汰率5% ～ 10%，哺乳豬死亡率不足2%。此外英國、法國、德國、意大利、北愛爾蘭、西班牙、新西蘭、墨西哥、阿根廷丹麥、韓國、日本等均有本病的發(fā)生和報(bào)道。血清學(xué)調(diào)查表明，PCV2 感染廣泛，多數(shù)豬群血清陽性率為20% ～ 50%。在北美和歐洲豬群中，發(fā)病率占被侵襲豬群的5% ～ 10%，發(fā)病死亡率達(dá)100%，德國屠宰豬血清中抗體陽性率達(dá)85%，英國隨機(jī)采集的豬血清樣品中血清陽性率達(dá)80%。比利時(shí)對1985—1999 年不同類型豬血清樣品檢測表明，PCV2 陽性率達(dá)100%，郎洪武等應(yīng)用ELISA 法對我國7 省市不同類型豬群559 份樣品進(jìn)行檢測，總陽性率達(dá)42.9%，表明PCV2感染在我國豬群中普遍存在。我國豬群中PCV2 感染情況也不容樂觀。我國對PCV2 的研究始于1999 年底，有學(xué)者對我國部分豬群的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)豬群中廣泛存在PCV2 抗體。
5、疫苗研究進(jìn)展
5.1 滅活疫苗
采用人工培養(yǎng)大量繁殖免疫原性好的病原微生物，滅活、濃縮后按一定比例加入佐劑制成的疫苗，稱為滅活疫苗，該疫苗可由病原微生物的完整個(gè)體組成，也可由其某些片段組成。滅活疫苗具有無毒、無害、效果穩(wěn)定的優(yōu)勢。國內(nèi)外對豬圓環(huán)病毒滅活疫苗的研究已取得了巨大進(jìn)展。法國梅利亞公司研究、開發(fā)的PCV2 油包水乳劑滅活疫苗，在歐洲一些國家已注冊上市，免疫后備母豬經(jīng)產(chǎn)母豬，仔豬可通母源抗體獲得保護(hù)，實(shí)驗(yàn)和臨床證明，該疫苗有較好的效果，可減少感染、排毒，減輕臨床癥狀。國內(nèi)現(xiàn)有3 種自主研發(fā)的豬圓環(huán)病毒常規(guī)滅活疫苗獲準(zhǔn)生產(chǎn)上市，其中PCV2 滅活疫苗LG 株由哈爾濱獸醫(yī)研究所研制，該產(chǎn)品免疫應(yīng)答快，效果好。另有南京農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的PCV2滅活疫苗SH 株和北京大北農(nóng)集團(tuán)研制的PCV2 滅活疫苗DBN-SX07 株。
5.2 弱毒疫苗
采用抗原性好的無毒株、天然弱毒株或人工誘變的弱毒株制成的疫苗稱為弱毒疫苗，該類疫苗具有不少優(yōu)點(diǎn)如接種數(shù)量少，可刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫、體液免疫和黏膜免疫，免疫效果好等，但也存在一些缺點(diǎn)如可能會(huì)發(fā)生毒力返強(qiáng)，儲(chǔ)存和運(yùn)輸需在冷凍條件下，易失活，易被細(xì)菌污染等。Fenaux 等將PCV2 于PK-15細(xì)胞上傳120 代， 結(jié)果120 代病毒比初代病毒滴度高出一個(gè)log 單位，同時(shí)，傳30 代后Cap 基因110 位脯氨酸變?yōu)楸彼?P110A) 并維持到120 代，此外191 位精氨酸變?yōu)榻z氨酸(R191S)，突變毒株在豬體內(nèi)的接種實(shí)驗(yàn)表明，PCV2120 代病毒血癥時(shí)間和豬血清病毒含量明顯低于第1 代，即PCV2120 代明顯致弱。也有人將PCV2 的ORF2 克隆到缺失ORF2的PCV1 的骨架中，得到PCV1-2 嵌合型病毒。研究表明，該嵌合型病毒是減毒的，能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，可作為制備PCV 弱毒疫苗的優(yōu)勢毒株，且具備不易發(fā)生毒力返強(qiáng)的優(yōu)勢。
5.3 亞單位疫苗
只含有病原微生物的抗菌抗原成分，而不含有核酸，但能刺激機(jī)體產(chǎn)生特應(yīng)性免疫應(yīng)答的一類疫苗，稱為亞單位疫苗。付玉潔等為評價(jià)豬圓環(huán)病毒(PCV)2a/2b 兩種基因型病毒株及其重組Cap 蛋白(rCap) 之間的交互免疫，采用重組桿狀病毒表達(dá)的2 種Cap 蛋白(PCV2a-rCap 和PCV2b-rCap)亞單位疫苗。免疫小鼠后進(jìn)行攻毒，結(jié)果，以PCV2a 和PCV2b各為指示病毒對病毒抗血清和rCap 蛋白抗血清進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)，同型病毒株與同型血清的中和抗體效價(jià)均高于異型病毒株。病理觀察顯示，免疫鼠均未見明顯病理變化，攻毒對照鼠肺臟出現(xiàn)一定程度的病理損傷。劉丹等以重組桿狀病毒表達(dá)的重組PCV2-Cap 蛋白制備亞單位疫苗，免疫BALB/c 鼠測定其抗體、中和抗體。結(jié)果表明，該蛋白亞單位疫苗能夠提供良好的免疫保護(hù)效果，能夠有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的體液免疫應(yīng)答。
5.4 核酸疫苗
構(gòu)建含有外源抗原基因的重組質(zhì)粒，免疫動(dòng)物后，表達(dá)的特異性抗原蛋白通過與MHC- Ⅰ 類或MHC- Ⅱ 類抗原分子結(jié)合，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，該類疫苗稱為核酸疫苗，又名DNA 疫苗。Kamstrup 等為了進(jìn)一步探索衣殼蛋白免疫預(yù)防的適用性，采用了pcDNA3.1/V5-His-TOPO真核表達(dá)載體克隆了PCV2 的ORF2 基因，并證實(shí)了此質(zhì)粒能夠在體外( 通過直接表達(dá)蛋白) 以及體內(nèi)( 通過對小鼠用基因槍注射質(zhì)粒，誘導(dǎo)小鼠免疫產(chǎn)生抗體)進(jìn)行表達(dá)。免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，所構(gòu)建的核酸疫苗均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。Aravindaram等用構(gòu)建的含PCV2 ORFl、ORF2、ORF3 的3 種重組質(zhì)粒單獨(dú)或聯(lián)合免疫小鼠，2 周后加強(qiáng)免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORF2/3 與ORFl/2/3 這2 種質(zhì)粒組合免疫后PCV2病毒載量顯著減少，誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ、TNF-α、GM-CSF以及PCV2 抗體水平均高于其他免疫組，小鼠的肺部病變也明顯減輕。史小紅等將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNAORF1-ORF2 免疫小鼠，2 周后加強(qiáng)免疫， 同時(shí)設(shè)置pcDNA-ORF1、p c D N A - O R F 2 、p c D N A 3 . 1 - ( + ) 、PCV2 全毒疫苗和PBS 對照。結(jié)果表明，該重組質(zhì)粒誘導(dǎo)產(chǎn)生PCV2 抗體水平與其他試驗(yàn)組相比差異顯著。閆若潛等[15]將豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）ORF2/ 豬白介素-2(PoIL-2) 嵌合重組表達(dá)質(zhì)粒(rpcDNA3.1/PCV2-1inker-PoIL-2) 免疫10 日齡健康仔豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒對豬體的免疫和免疫保護(hù)效果顯著。
5.5 活載體疫苗
采用弱毒或無毒病原微生物作為表達(dá)載體，對其導(dǎo)入外源抗原基因，制成疫苗后，接種動(dòng)物，誘導(dǎo)機(jī)休產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，這類新型疫苗稱為活載體疫苗。Wang 等將PCV2 ORF2克隆入E.coli/L.lac分泌型穿梭表達(dá)載體pSEC:LEISS，構(gòu)建了重組穿梭載體pSEC:LEISS-dCap，電轉(zhuǎn)化乳酸菌NZ9000，獲得能有效表達(dá)Cap 蛋白的重組乳酸桿菌，將該菌培養(yǎng)液經(jīng)口灌喂對Balb/c 小鼠的生長發(fā)育沒有影響，無毒性作用，能夠誘發(fā)小鼠產(chǎn)生抗Cap蛋白的特異性IgG 抗體，刺激腸道黏膜淋巴組織對其產(chǎn)生黏膜免疫。Pei 等在PRRSV cDNA 克隆的ORFs1b 與2a插入2 個(gè)限制性酶切位點(diǎn)及1 個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，將其改造成一個(gè)病毒載體，然后將PCV2ORF2 基因插入2 個(gè)限制性酶切位點(diǎn)間，由插入的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)染Marc-145 細(xì)胞獲得了P129-PCV 重組PRRSV，2 次免疫仔豬，首免后3 周內(nèi)，母源抗體存在，抗體水平不斷下降，而二免后1 周，免疫豬產(chǎn)生了PCV2 特異性的抗體應(yīng)答，結(jié)果表明PRRSV 能成功表達(dá)豬其他病原的免疫原性蛋白，并誘發(fā)特異性的免疫反應(yīng)，可以作為表達(dá)外來病原的豬疫苗載體。宮婷等構(gòu)建了表達(dá)豬圓環(huán)病毒2 型Cap 蛋白重組復(fù)制缺陷型人5型腺病毒，對重組腺病毒的分子生物學(xué)鑒定和在小鼠上的初步免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，重組腺病毒可介導(dǎo)Cap 蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)，并且表達(dá)的靶蛋白具有較好的免疫原性，為進(jìn)一步將其開發(fā)成新型PCV2 疫苗奠定了基礎(chǔ)。王子龍等利用NDV LaSota 弱毒疫苗株為活病毒載體，通過反向遺傳操作系統(tǒng)構(gòu)建出表達(dá)PCV2Cap 的重組病毒(rLa-PCV2/Cap)，以及表達(dá)刪除核定位信號(NLS) 的Cap(CapΔ41) 的重組病毒(rLa-PCV2/CapΔ41)，并對外源蛋白的表達(dá)效果進(jìn)行了檢測，為研究新型PCV2疫苗奠定基礎(chǔ)。鈔安軍等將PCV2 ORF2 基因插入到PRV 通用載體pG 中，成功構(gòu)建了重組病毒PGO，并用該重組病毒免疫6 周齡雄性小鼠并檢測分析了PGO 的免疫原性，結(jié)果表明，該重組病毒能有效抵抗PCV2 強(qiáng)毒攻擊。
